Debido a la incapacidad de los retrovirus para invadir
las células
que no se dividen, se han estudiado otros sistemas de
cesión que no tengan esta limitación. Un ejemplo
importante es el adenovirus, un virus con DNA
con doble filamento utilizado a menudo en las preparaciones de
vacunas.
Igual que el retrovirus, el adenovirus puede aceptar un inserto
que no supere los 7 u 8 Kb de longitud. Antes de su empleo en
terapia génica se han de manipular los adenovirus para
que tengan una replicación diferente.
En la actualidad se están utilizando adenovirus
en estudios en los que el gen CFRT normal es administrado, por
un método
en aerosol, a las células epiteliales que revisten los
pulmones (terapia génica in vivo). Se espera que este
tratamiento logre alterar la actividad de los canales del cloro
en los pacientes con fibrosis quística. Un inconveniente
de los adenovirus es que no se integran en el DNA de la
célula huésped.
Por lo tanto, finalmente se pierden, originando una
expresión del gen transitoria y la necesidad de
reintroducción del vector.
4.2.1.3 Terapia génica
en enfermedades
no hereditarias
Por ejemplo en el tratamiento del melanoma maligno se
ha insertado ex vivo un gen codificador de factor de necrosis
tumoral (TNF: tumor necrosis facto) en linfocitos que infiltran
tumores. Aunque el TNF es toxico administrado por vía
sistémica, se espera que los linfocitos que infiltran
tumores, que tienen como objetivo
natural los melanomas, dirijan de forma específica el
TNF hacia los tumores y los destruyan.
La terapia génica se esta ensayando
también en el tratamiento de la artritis reumatoide y su
objetivo consiste en bloquear los efectos inflamatorios de la
interleucina (IL-1). Se inserta un gen codificador de la
proteína antagonista del receptor IL-1 (IRAP) en las
células sinoviales que revisten las articulaciones, limitando así la inflamación causada por IL-1.
La terapia de células somáticas consiste
en la alteración únicamente de las células
somáticas especificas y, por lo tanto, difiere poco en
principio de muchos otros tipos de intervención medica
(P. Ej. los transplantes de medula ósea). En cambio, la
terapia génica germinal implica la alteración de
todas las células del cuerpo, incluyendo las que
originan a los gametos. Por lo tanto, este tipo de terapia
génica no solo afectaría al paciente sino
también a todos sus descendientes.
La terapia de línea germinal se desarrollo
por primera vez en ratones en 1983, cuando se introdujeron con
éxito
copias del gen de la hormona del crecimiento humano en
embriones de ratones mediante microinyección (el gen se
inserta directamente ene. Interior del embrión
utilizando una pequeña aguja). En la minoría de
embriones en los que se integró el gen también se
produjo una modificación de los gametos y el gen de
hormona del crecimiento humana se transmitió a las
sgtes. Generaciones (los ratones alcanzaban un tamaño
anormalmente grande).
Aunque en principio la terapia de línea
germinal es posible en los seres humanos plantea importantes
problemas.
En primer lugar, los embriones inyectados suelen morir y
algunos desarrollan tumores y malformaciones. En segundo lugar,
incluso en un trastorno autosómico dominante, la mitad de los
embriones serán genéticamente
normales.
Si fuera posible distinguir los embriones
genéticamente normales (P. Ej. mediante
diagnósticos por PCR de productos
fecundados in vitro), seria más fácil implantar
los embriones normales que alterar los anormales. Por ultimo,
existen numerosas cuestiones éticas asociadas con la
alteración permanente de la herencia
genética humana. Por estos motivos,
parece improbable que la terapia de la línea germinal
humana sea útil o deseable.
Existe una gran esperanza para pacientes afectados por
alguna enfermedad puedan ser tratados por
terapia génica, por la cual, se le sustituye un gen
defectivo por un gen normal. Aún así, los
obstáculos que supone la terapia génica son muy
importantes.
Se necesita mucha información sobre la patología
molecular de un desorden genético, antes de que los
investigadores puedan decidir si este desorden es factible a la
terapia génica, y si es así, también
habría que tener en cuenta diferentes asuntos sociales y
éticos.
El gen en cuestión debe ser clonado y
además debe existir una manera segura de introducir el gen
en las células. Los primeros experimentos en
los que células tratadas genéticamente o
manipuladas, y fueron introducidas en pacientes humanos
comenzaron en 1.989, y las primeras pruebas
clínicas sobre terapia génica, para las eficiencia de
adenosina desaminasa, comenzaron el Septiembre de
1.990.
A continuación discutiremos las técnicas
de terapia génica empleadas en las diferentes enfermedades
humanas así como sus problemas y resultados.
Se han utilizado muchos experimentos en los que se
usaron cultivos celulares para encontrar un camino eficiente para
introducir genes humanos en células sin que sufran
reordenamientos u otras alteraciones que puedan afectar a la
expresión génica, es decir, que el gen introducido
sea estable.
El gen para la fibrosis quística (CF) era un
objetivo importante para la terapia génica. In vivo se
habían descrito anormalidades en la conductancia en los
canales de cloro, y una línea celular CF- expresaba el
mismo defecto. Esta línea celular se utilizó en
ensayos que
intentaban estudiar la actividad del gen CF introducido en la
célula.
Uno de los vectores que más se han utilizado en la lucha
contra la fibrosis quística ha sido el vector retroviral.
Un ADNc para el gen regulador de la conductancia transmembrana de
la fibrosis quística (CFTR) era construido por el
solapamiento de tres clones ADNc, y un ADNc completo era clonado
en un vector retroviral.
Las células CF- eran infectadas por un vector
retroviral que llevaba un gen CFTR, y la célula con el
provirus integrado eran seleccionadas por su resistencia al
G418. Las células expresaban el gen CFTR. Los datos más
interesantes procedían de las medidas del grado de
funcionamiento de los canales para el cloro.
El flujo aniónico de las células en
respuesta a una estimulación por la adenilato ciclasa
proporciona una conductancia para el cloro semejante. En ausencia
de un determinado estimulador de la adenilato ciclasa, el flujo
aniónico de las células CF- y de las células
CF- que contienen el gen CFTR introducido se pierde. Si se le
adiciona este determinado activador de la adenilato ciclasa, el
flujo aumenta rápidamente en células CF- con CFTR ,
pero en las células CF- el flujo permanecía bajo.
Se utilizaron técnicas electrofisiológicas para
determinar si la conductancia para el cloro influía en ese
flujo aniónico.
Estos experimentos mostraron que las corrientes de cloro
se detectaban únicamente en las células CF- con
CFTR. Significativamente, la respuesta de las células CF-
con CFTR es comparable con las respuestas traqueales humanas
normales y alienta la esperanzas de que la terapia génica
para la fibrosis quística , usando vectores retrovirales
directamente sobre el epitelio pulmonar por medio de aerosoles,
sea posible.
5.2 Fibroblastos de la
piel
utilizados en terapia génica
Un tipo de células que sirve como vehículo
para transferir genes son los fibroblastos de la piel. Estas
células han sido usadas en pacientes afectados de
mucopolisacaridosis, que es una enfermedad hereditaria que se
caracteriza por la deficiencia de enzimas
lisosomiales.
Los fibroblastos se obtienen fácilmente crecen
bien en cultivo, y pueden ser infectadas eficientemente con
vectores retrovirales. Por ejemplo, las células de un
paciente afectado por la enfermedad de Gaucher (deficiencia de
glucocerebrosidasa) eran infectadas con un vector retroviral que
contenía un ADNc de la glucocerebrosidasa. Los niveles de
enzima en las células infectadas alcanzó el nivel
de las células normales.
En el caso de la deficiencia de adenosina desaminasa,
los fibroblastos de la piel infectados con un retrovirus que
llevaba un ADNc de ADA producía más ADA que las
células normales. Los investigadores calculan que se
necesitan más de 4x10e8 fibroblastos tratados
genéticamente para producir efecto terapéutico en
pacientes.
Una cuestión importante sería conocer si
los fibroblastos de la piel podrían sintetizar y secretar
gran cantidad de una proteína que no es un producto
normal de esa célula. Por ejemplo, ¿podría
un fibroblasto de la piel tratado genéticamente ser usado
para producir el factor IX en pacientes con hemofilia
B?
Los fibroblastos humanos son infectados in vitro por un
vector retroviral basado en un MoMLV, que contiene un ADNc del
factor IX dirigida por un promotor intensificador de un
citomegalovirus. Por radioinmunoensayo se determinó que
estas células infectadas producían gran cantidad de
factor IX. Este factor IX es completamente funcional e
indistinguible del factor IX original del plasma.
Como conclusión, los últimos avances a la
hora de perfeccionar las técnicas tanto en el cultivo de
células de la piel como de producir vectores estables y
fiables para expresar e introducir información
genética en estas células, unidos a la relativa
facilidad con que estos cultivos son transplantados , hacen
suponer que, en años venideros, la piel será uno de
los primeros y más atractivos sistemas para corregir
enfermedades mediante terapia génica, contribuyendo
así a la revolución
de los métodos
terapéuticos que esta nueva disciplina,
sin duda, introducirá en la Medicina.
5.3 Terapia génica
aplicada a hepatocitos
Otro tejido diana para la terapia génica es el
hígado . Un gran número de enfermedades
metabólicas hereditarias afectan al hígado, y el
transplante de hígado ha sido utilizado para tratar estas
enfermedades y otras como son la hipercolesterolemia y hemofilia.
Estas técnicas se han desarrollado a partir de aislamiento
y cultivo de hepatocitos.
Ejemplos de la utilización de estos hepatocitos
es el estudio y tratamiento por terapia génica de la
hipercolesterolemia en humanos. Esta es una enfermedad
hereditaria causada por mutaciones en el receptor de la
lipoproteína de baja densidad (LDLR),
y aquellos pacientes que son homocigóticos para la
mutación del gen de LDLR generalmente mueren por un ataque
al corazón
antes de los 20 años.
En este experimento los vectores retrovirales que llevan
el gen para el LDLR humano se usan para infectar cultivos de
hepatocitos. Se obtenían líneas celulares que eran
capaces de degradar las lipoproteínas de baja densidad a
un nivel más o menos normal. Hasta ahora este experimento
sólo se ha utilizado en cultivos celulares ¡, aunque
es uno de los más seguros a probar
en individuos.
Un experimento que se quiere hacer en humanos y que
ahora sólo se hace en ratones es transferir los genes
alfa-1 antitripsina humanos (hAAT) y el gen beta-galactosidasa de
E. coli a hepatocitos.
5.4 Linfocitos modificados
genéticamente
Un sistema de
entrega a células de melanomas malignos está siendo
utilizada en experimentos clínicos. Los linfocitos
infiltrantes en tejidos (TILs)
son linfocitos que se infiltran el tumores sólidos y que
pueden matar células tumorales si se administran junto a
la interleuquina 2 (IL-2),que es un factor decrecimiento de
linfocitos. Cuando los TILs eran aislados de melanomas malignos,
estimulados en su crecimiento en un cultivo tisular con IL-2, y
se inyectaban de nuevo al paciente, en ocasiones producían
la regresión del melanoma.
Para intentar conocer como los TILs trabajan in vivo, es
importante conocer cuantos de los TILs transplantados sobreviven
y si alcanzan los tumores. Una estrategia que se
ha desarrollado para seguir los TILs inyectados al paciente es
marcarlos con retrovirus. La primera vez que se hizo este
experimento en células humanas genéticamente
modificadas se utilizó un vector retroviral que llevaba el
gen de resistencia a la neomicina.
Antes de que los experimentos clínicos
comenzaran, se ha visto que los TILs eran eficientes y
establemente infectadas con un vector, que eran muy resistentes
al G418 y de que la integración retroviral no alteraba la
característica de crecimiento de las células. Cinco
pacientes fueron tratados con estos TILs. Se le retiró al
tumor a cada paciente y los TILs se hicieron crecer en un cultivo
con interleuquina-2 .
Las células infectadas con un vector retroviral
en los que los genes gag, pol y env fueron
sustituidos por el gen para la resistencia a la neomicina. El
porcentaje de las células en las que el neogén se
había integrado establemente era del 1-11%. Los pacientes
recibieron al menos 10e11 TILs que procedían de sus
propios tumores. Muestras de sangre tomadas en
días siguientes fueron sometidas a la PCR, y se vio que
los TILs modificados genéticamente que contenían el
neogén estaban presentes en tres pacientes. Sesenta
días después sólo se detectaba en dos
pacientes. Aún así, se encontraron células
que contenían el neogén en muestras de tejido
tumoral, pero no está claro si estas células
tomaron este neogén por suerte o por transferencia de un
vector.
La conclusión que se sacó, es que los TILs
son útiles para tratar células tumorales, pero
todavía no se ha comprobado el rendimiento que puede
sacarse de esta facultad ya que los resultados son
contradictorios según diferentes pruebas.
5.5 Utilización de
células hematopoyéticas en la expresión de
células en animales
De la misma manera que el retrovirus actúa como
un vector para transportar un gen a una célula, la
célula puede ser considerada como un vector en el
siguiente paso del proceso, que
es transportar el gen al cuerpo del paciente.
¿Qué requisitos deben cumplir estas
células? Deben ser fáciles de obtener, crecer bien
en cultivo y de soportar la infección retroviral.
Después de la infección, la célula vector
debería ser fácil de devolver al paciente y
debería continuar viva por varios meses, preferentemente
por el bien del paciente. Las células de la médula
poseen algunas de estas características. La médula
contiene células stem que pueden dar lugar a todas las
células de la serie hematopoyética. La
infección de estas células stem hace que aparezcan
diversas que contengan el gen terapéutico.
También se han utilizado las células de la
médula para tratar enfermedades hematopoyéticas, en
otras palabras, las técnicas para reconstruir la
médula de los pacientes se está trabajando
intensamente. Uno de los mayores inconvenientes de usar
células de la médula como vectores celulares, es
que tienen dificultad de producir altos niveles de
expresión del gen introducido.
En uno de los experimentos, el gen intacto de la
beta-globina humana con secuencias adyacentes en 3' y 5' son
usadas en la construcción de retrovirus. El retrovirus
que lleva el gen de la beta-globina se inyectaba en las
células de la médula y posteriormente se vio que
eritrocitos que procedían de estas células
medulares llevaban beta-globina funcional.
5.6 Deficiencia de
adenosina desaminasa (inmuno deficiencia combinada
grave)
Se debe a un trastorno autosómico recesivo. Su
deficiencia origina una disfunción intensa en las
células T y B , que provoca la muerte de
los pacientes antes de los dos años de edad por
infección masiva. Se comenzó a estudiar su
tratamiento por terapia génica en 1.990 para una
mutación en el gen adenosina desaminasa. Los niños
aquejados de este mal eran incapaces de iniciar una respuesta
inmunitaria ante las infecciones y estaban abocados a una vida
muy limitada, ( "niños burbuja"). Sin una especial
atención morían
irremediablemente.
Dos niños de cuatro y nueve años con
deficiencia de ADA están recibiendo terapia génica.
De los niños se aíslan linfocitos T, a los que se
les introduce un gen ADA normal usando un vector retroviral, y
son devueltos a los pacientes. Los niños han estado
recibiendo células con genes corregidos cada uno o dos
meses durante un año y estos niños mostraron
mejoras clínicas significativas.
Ahora son capaces de iniciar una respuesta inmunitaria y
se ha producido una importante decreción del número
de infecciones. El niño de menor edad, que ha sido tratado
por más tiempo, puede
llevar una vida completamente normal. Estos resultados son muy
esperanzadores, y si la terapia génica en células
stem de la médula avanza, no será necesario un
injerto continuo de células modificadas.
Actualmente, el tratamiento preferido es el transplante
de médula ósea de un donante HLA idéntico,
que puede producir una curación completa aunque conlleva
una alta morbilidad . Pero menos de un 30% de los pacientes
tienen un hermano HLA idéntico.
La sustitución enzimática no consigue una
restitución completa y produce otros efectos
tóxicos. Un tratamiento sustitutorio consiste en inyectar
el enzima ADA combinada con polietilenglicol (PEG) permite en
ciertos casos frenar los efectos de la enfermedad. Pero es un
tratamiento muy caro, ininterrumpido y de eficacia
inconstante.
Tras numerosos experimentos en organismos modelo, se
iniciaron hace ya más de cuatro años ensayos
clínicos de transferencia génica de ADA hacia los
linfocitos T periféricos, previamente tratados in vitro.
Aunque algunos pacientes experimentaron una notable
mejoría clínica e inmunitaria, los resultados
difieren considerablemente de unos a otros y no llegan a
normalizarse todos los índices de la función
inmunitaria.
En opinión de algunos, ni en este pionero
ensayo ni en
otros existen evidencias
inequívocas de que el tratamiento genético ha
producido beneficios terapéuticos . Los riesgos de
posible mutagénesis insertiva de genes relacionados con
el
cáncer, después de repetidas transferencias
retrovirales, no se han visto confirmadas hasta el momento . Pero
los modestos resultados han estimulado otras propuestas de
ensayos clínicos en Italia y
Países Bajos.
Según sus autores, en uno de estos últimos
ensayos la transferencia genética había funcionado
y se había conseguido la reconstitución
inmunitaria. En todo caso, es preciso tener en cuenta que los
pacientes estuvieron recibiendo también inyecciones
rutinarias de ADA sintética, y estos tratamientos
convencionales podrían ser responsables en buena parte de
su buena salud.
5.7 Transferencia de
mioblastos usada para tratar la distrofia muscular
Duchene
Los mioblastos son las células stem del
músculo esquelético. Durante el desarrollo, los
mioblastos se fusionan para formar fibras musculares
multinucleadas. Un pequeño número de mioblastos no
se fusionan y forman células individuales, llamadas
células satélite, que se
sitúan entre las membranas de las fibras musculares y de
la matriz
extracelular que cubre las fibras musculares.
Las células satélite poseen la habilidad
de fusionarse con otras células satélite y fibras
musculares para tomar parte en la regeneración muscular.
Los mioblastos se convierten así en las células
vector ideal para transportar genes a las fibras
musculares.
Un obstáculo en la terapia génica de la
DMD es que el gen y su ADNc son muy grandes. Esto se ha
conseguido superar por la construcción con un ADNc
completo para la distrofina, que se puede expresar en
células. Dos ADNc biblióteca ( A y B ) fueron
construidos en los cuales la reversotranscriptasa fue
directamente a comenzar la síntesis
de las primeras cadenas de ADN en dos puntos
del ARN mensajero de la distrofina.
Estos puntos se especificaron por suplantar dos primers
que hibridaban por la mitad (biblioteca A) o
con el extremo 3' (biblioteca B) del ARN mensajero. Estos clones
contenían 78Kb. del extremo 5' del gen y 8 Kb. fueron
aisladas del extremo 3' de la biblioteca A y B respectivamente.
Estos clones fueron solapados en 18 Kb. y se ligaron a una
porción de un sitio de restricción para dar un ADNc
completo. Esto se clonó en un vector SV40 y se
transfectó por electroporación en células
COS.
Usando anticuerpos para la distrofina demostraron que se
producía una molécula correcta de distrofina en las
células COS, y estudios inmunofluorescentes demostraron
que se localizaba en la membrana celular. Aunque estos
experimentos demuestran que genes grandes como el de la
distrofina pueden ser manipulados in vitro, pero puede pasar
mucho tiempo hasta que esta terapia pueda tener aplicaciones
clínicas.
5.8 Terapia génica
en la cura del cáncer
El diagnóstico del cáncer a nivel
molecular permitirá un pronóstico más
preciso; pero aún podemos llegar más lejos
utilizando una terapia génica que tiene como finalidad la
destrucción selectiva de la célula tumoral. La
pérdida del oncosupresor p53 puede ser corregida
introduciendo una copia sana en la célula
neoplásica; la sobreexpresión del oncogén
k-ras también puede suprimirse introduciendo el gen k-ras
antisentido que inactive su expresión o bloquee sus
ARNs.
Los retrovirus permiten introducir genes, potencialmente
suicidas, en el seno de un tumor ya que infectarán e
insertarán su ADNc en células en división;
los adenovirus, aunque no integren en el huésped pueden
permanecer activos el tiempo
suficiente para destruir el tumor. También es posible
introducir en el tumor o en el organismo genes
inmunoestimulantes, como la interleuquina (IL2) , que
potencialmente protege de distintos tipos de cáncer y de
sus recidivas.
Las inmunotoxinas son el resultado de acoplamiento de
toxinas muy letales (como la diftérica o la ricina) a
anticuerpos monoclonales específicos de carcinomas,
constituyendo las denominadas bombas
biológicas, puesto que son como proyectiles
letales dirigidos contra células tumorales. Por
último , la terapia génica permite elaborar vacunas
a partir de las propias células tumorales de un paciente
por manipulación ex vivo y reinserción en el
organismo de partida.
Dentro del campo de las aplicaciones de la terapia
génica en el hombre, se
puede considerar el cáncer como el área más
importante y de más rápida
expansión.
5.8.1 Sustitución
de oncosupresores defectuosos por ingeniería genética
Las propiedades neoplásicas de numerosos
cultivos celulares pueden revertirse con frecuencia, al
insertar una copia normal de un oncosupresor como pueden ser
rb, dcc o p53. Es muy posible que la introducción de p53 en un tumor que
carezca de la función de este gen, pueda restaurar la
normalidad tisular.
Se están realizando ensayos clínicos en
los que se depositan broncoscópicamente en las
inmediaciones de un tumor de pulmón , retrovirus que
llevan una copia intacta de p53. La eficacia de esta terapia se
verá incrementada si en vez de hacer llegar al tumor un
único oncosupresor, se elaboraran "lotes génicos"
de varios oncogenes y oncosupresores que simultáneamente
corrijan las alteraciones acumuladas en las células del
tumor.
Un único vector que porte varios
oncogenes/oncosupresores o una mezcla de vectores que contenga
cada uno un tipo de oncogenes/oncosupresores son las dos
modalidades con las que se especula en la
actualidad.
5.8.2 Inhibición
molecular de la expresión de oncogenes
Tanto los tumores sólidos como las leucemias y
linfomas exhiben activación mutacional o
sobreexpresión de oncogenes u oncosupresores mutados ;
la malignidad de las células podría desaparecer
impidiendo la expresión de los oncogenes y
oncosupresores por administración de pequeños
oligodesoxinucleótidos complementarios a los ARNs
mensajeros y ADNs correspondientes.
Debemos aclarar, sin embargo, que este tipo de
tratamiento difiere sustancialmente de las terapias
genéticas tradicionales. En la mayoría de los
tratamientos genéticos, se suministran genes enteros y
sanso para sustituir las versiones que faltan o que son
defectuosas e incapaces de dirigir la síntesis de una
proteína necesaria. Los oligonucleótidos no
pueden producir proteínas. Su virtud radica en la
capacidad para bloquear la expresión de genes
existentes.
Los oligonucleótidos antisentido son la primera
de las nuevas medicinas genéticas que han llegado a la
etapa de ensayo clínico. De su potencialidad
terapéutica se sospechó ya a principios de
los 80, cuando se descubrió que ciertos microbios,
además de fabricar ARNs mensajeros, también
producían de forma natural ARN antisentido.
La explicación más lógica para este comportamiento parecía ser que el
organismo utilizaba las moléculas antisentido como forma
de regular la expresión génica. Si el ARN
antisentido se empareja con su molécula complementaria
de ARN mensajero, cabe pensar que bloqueará la
maquinaria celular encargada de traducir en proteínas la
cadena con sentido.
Las células vegetales y animales
emplean a veces la estrategia antisentido para controlar la
expresión génica. Con la ayuda de las
técnicas del ADN recombinante crearon genes que
producían versiones antisentido de ciertos ARN
mensajeros seleccionados. Cuando se introducían esos
genes en las células se comprobaba que, en efecto,
ocasionalmente se conseguía disminuir la producción de la proteína cifrada
por la cadena de ARN que era blanco del antisentido.
Los resultados sugerían la posibilidad de
diseñar moléculas antisentido que funcionasen a
la manera de drogas e
impidiesen selectivamente la traducción. Sin embargo, para utilizarlas
como tales drogas, había que enviarlas al interior de
las células del cuerpo, y hacerlo de una forma
fácil y eficaz. En la mayoría de los casos, lo
mejor sería administrar pequeños fragmentos de
antisentido sintéticos, en vez de genes
enteros.
La construcción del primer oligómero
surgió en 1.978, reconocía el ARN mensajero del
virus del sarcoma de Rous y disminuía su
replicación en la célula lo que indicaba que
había bloqueado la producción de proteínas
víricas.
Dos consideraciones a la hora de fabricar un
oligonucleótido son: primero, los
oligonucleótidos sin modificar portan una carga negativa
en la cadena del grupo
fosfato. Las moléculas dotadas de carga suelen tener
dificultades para atravesar las membranas celulares, que no
están cargadas.
La mayoría de los investigadores daban por
supuesto que los oligómeros con muchas cargas
serían incapaces de entrar eficazmente en las
células. En segundo lugar, las células poseen
numerosas enzimas que degradan el ADN foráneo.
Cabía pensar entonces en una pronta degradación
de los oligómeros que consiguiesen entrar en las
células.
Para ello reemplazaron un átomo de
oxígeno de cada grupo fosfato por un
grupo metilo (-CH3 ). Convertían así los fosfatos
cargados negativamente en unidades sin carga: los
metilfosfonatos. De esa manera los oligonucleótidos
entraban mejor en las células y resistían el
ataque enzimático. Pero al eliminar las cargas, los
oligómeros se volvían hidrofóbicos y se
hacían insolubles en soluciones
acuosas, esta falta de solubilidad puede dificultar la
producción en masa.
Otra alternativa a los metilfofonatos era intercambiar
un átomo de oxígeno de los grupos fosfato
por un átomo de azufre cargado negativamente. Estos
oligómeros fosfotiolados son conocidos como
oligos S, que son solubles en agua,
fáciles de producir y resistentes a la
degradación enzimática.
Los oligonucleótidos antisentido pueden
bloquear la traducción al menos de dos maneras.
Obstaculizan la "lectura"
normal del ARN con sentido y, además, al unirse al ARN
mensajero estimulan a una enzima (ribonucleasa H) que corta, y
por tanto destruye, al ARN mensajero que participa en la
unión.
Los oligonucleótidos son muy caros y la
estabilidad de los compuestos debe mejorarse. Habrá que
elaborar métodos más idóneos para
introducirlos en las células en las cantidades
adecuadas.
Una nueva estrategia genética está
basada en los llamados tríplices, que
son oligonucleótidos sintéticos que actúan
igualmente pero a nivel del ADN, en este caso una tercera banda
se acomoda entre las dos existentes en el surco mayor de la
forma B del ADN. Hoy sabemos que los oligonucleótidos
suelen unirse a una de las cadenas de la doble hélice, y
sólo a las bases púricas de esa cadena mediante
uniones de tipo Hoogsteen. Así, los
oligonucleótidos son capaces de unirse a la
región de control del
gen diana, para impedir que los factores de
transcripción iniciasen dicho proceso.
Hasta el momento in vitro, han tenido éxito
oligonucleótidos contra ras, p53, myc, myb, bcr-abl,
bcl-2 y contra el factor de crecimiento semejante a la
insulina.
Se encuentran en fase clínica la
utilización de oligonucleótidos contra el factor
de crecimiento similar a la insulina (IGF-1) que va asociado al
desarrollo de tumores cerebrales malignos (glioblastomas). En
la fase preclínica, se introdujeron in vitro
moléculas de ARN antisentido en células tumorales
procedentes de un glioblastoma de rata, estas células se
inyectaron en ratas genéticamente idénticas con
tumores cerebrales. Los tumores desaparecieron incluso en ratas
con tumores extendidos a otras partes del cuerpo. Las
células introducidas desencadenaron una respuesta
inmunológica estimulando células T
citotóxicas que erradicaron el tumor o los tumores a la
vez que protegieron al organismo de la aparición de
nuevos microtumores.
En las pruebas clínicas, son células del
propio paciente las que se modifican ex vivo con la
introducción del ARN antisentido. Se ha elegido ARN en
vez de ADN para el bloqueo del ARN mensajero de IGF-1 porque
los híbridos ARN-ARN son más estables que los
ADN-ARN.
La inhibición de la expresión del
oncogén ras se puede conseguir in vitro con la
inserción en la células tumorales de genes que
transcriban un ARN mensajero antisentido, complementario al ARN
mensajero normal del oncogén ras. Estos antigenes
eliminan específicamente la producción del
producto ras anormal a nivel de ARN mensajero por hibridar con
él, impidiendo así que sean sustrato de
traducción por los ribosomas celulares. El mayor
problema de esta terapia génica es asegurarse de que
todas las células tumorales reciben el
oligonucleótido antisentido, ya que cualquiera que
escape tendrá una ventaja proliferativa sobre las otras
y prevalecerá induciendo de nuevo el tumor.
El segundo método de bloqueo del oncogén
ras actúa a nivel de proteína. La proteína
Ras ocupa una posición importantísima en la
transmisión deseñales para que la célula
responda a los factores de crecimiento. Las mutaciones Ras
producen una transmisión continua de señales de proliferación
independientemente de la presencia de los factores
estimulantes.
Tanto la proteína Ras normal como la mutada
precisan de una transformación o maduración que
las convierta en proteínas biológicamente activas
y esta modificación consiste en una
farnesilación, es decir, la adquisición de un
grupo farnesil que permitirá a la proteína
anclarse en su lugar habitual de la membrana celular, desde
donde transmite la señal de proliferación. La
farnesil transferasa es la enzima que normalmente facilita el
grupo farnesil; así, inhibidores de la enzima
impedirán que Ras adquiera su forma
biológicamente activa.
El compuesto CBBX (cisteína, 2 Benzodiacepinas
y un aminoácido variable) es muy buen inhibidor de la
farnesil transferasa y parece inocuo para las células.
Células transformadas en cancerosas por haberles
introducido un gen ras mutado, se incubaron en presencia del
compuesto CBBX, impidiéndose de modo muy eficiente la
farnesilación y observándose un crecimiento
típico de células normales no cancerosas. La
inhibición no ha de ser total puesto que las
células necesitan una cierta cantidad de Ras para
funcionar correctamente; además hay otras
proteínas que han de farnesilarse para adquirir su
capacidad funcional. Es necesario controlar muy bien las dosis
para que se inhiba la enzima lo suficiente para impedir un
crecimiento incontrolado, pero permitiendo el resto de las
funciones de
la célula.
La inhibición de oncogenes en células
tumorales in vitro es un requisito imprescindible para su
utilización in vivo. En animales de
experimentación (ratas) estas técnicas han
logrado la desaparición de tumores experimentales sin
aparición de recidivas o secuelas de otro
tipo.
5.8.3 Inserción
tumoral de vectores suicidas: expresión constitutiva o
selectiva
Los vectores suicidas que se emplean para erradicar
tumores son preferentemente retrovirus defectivos en los que
los genes propios del virus ( gag, pol y env) han sido
sustituidos por un gen de selección (neo) y por otro gen capaz de
inducir su propia muerte. Un
ejemplo de gen suicida es el gen de la timidina quinasa (tk)
del Herpes
simplex (HS), que al expresarse en la célula tumoral
confiere sensibilidad al antibiótico
antiherpético ganciclovir. La quinasa del Herpes no es
tan estricta como su homóloga celular y fosforila
análogos de la guanina (ganciclovir o aciclovir), que
pueden así ser insertados e incorporados en la
molécula del ADN paralizando la replicación y
provocando la muerte celular.
Solamente aquellas células que hayan adquirido
la quinasa del Herpes incorporarán células en
división, característica diferencial de las
células tumorales que se desarrollan en tejidos
especializados, las cuales normalmente ya no se dividen. El
cerebro adulto
es uno de los órganos en los que no hay divisiones
celulares en condiciones normales. El sistema se ha puesto a
punto en la rata, donde pueden ser inducidos tumores cerebrales
malignos por inyección directa de células
neoplásicas.
Los retrovirus portadores del gen tk del HS se
introdujeron en las células murinas empaquetadoras que
poseen en su genoma un retrovirus defectivo. Este retrovirus
defectivo es poseedor de los genes que se eliminaron del
retrovirus para convertirlo en vector ( gag, pol y env ), pero
carece de una región imprescindible para el
empaquetamiento de la partícula; estas células
murinas se convierten entonces en fábricas de retrovirus
terapéuticos y se denominan células
productoras.
La introducción en el seno de un tumor cerebral
de células productoras origina un gran número de
retrovirus que infectarán lógicamente las
células próximas del tumor. Al cabo de unos
días, en los que cada vez más células
tumorales adquieren el retrovirus terapéutico, se inicia
el tratamiento de la rata con el ganciclovir, que ,
efectivamente es capaz de provocar el suicidio de
todas las células tumorales .
En humanos, el mismo tratamiento de tumores cerebrales
malignos por terapia génica con retrovirus portadores
del gen tk del Herpes, se encuentra en la actualidad en fase de
ensayos clínicos; el tratamiento del enfermo con
ganciclovir produce en algunos casos la disminución del
tumor tratado. Tratamientos similares se están aplicando
también a otros tipos de tumores, como melanomas
cutáneos o cánceres de ovario.
Una variante más versátil y selectiva se
podría conseguir añadiendo al gen suicida un
promotor de células tumorales. Se conocen algunos genes
que se expresan preferentemente en determinados tumores, en
muchos de estos casos se han aislados los promotores y se han
acoplado enzimas que confieren un efecto suicida.
Un promotor específico de un tipo de tumores
impediría que la enzima suicida se expresara en
cualquier otra célula distinta a la neoplásica,
aunque pudiera ser infectada por el retrovirus
terapéutico por encontrarse en fase proliferativa. Se
prevee su uso clínico en un futuro próximo para
hepatomas, melanomas, cánceres de mama y cánceres
de páncreas.
5.8.4 Inmunotoxinas para
combatir el cáncer
Con el descubrimiento de los anticuerpos monoclonales
surgió la idea de elaborar inmunotoxinas para el
tratamiento del cáncer acoplando anticuerpos tumorales
específicos a toxinas mortales. Estas inmunotoxinas se
unirían y matarían células
neoplásicas. Se les denominó bombas
biológicas o balas mágicas, ya que
funcionan como proyectiles dirigidos para hacer blanco en
células cancerosas. Problemas de toxicidad en las
aplicaciones terapéuticas pusieron de relieve que
simplemente pegando un anticuerpo a una toxina no se
curaría el cáncer.
Aunque no se han resuelto todos los problemas
originales, se puede decir que las inmunotoxinas actuales
están muy mejoradas y ya se están realizando
ensayos clínicos que permitirían muy pronto evaluar
el alcance de esta tecnología en la cura
del cáncer. Para eliminar un cáncer humano todas
las células neoplásicas deben quedar expuestas a
suficiente cantidad de inmunotoxina como para provocar su
destrucción sin causar daños adicionalesen las
células normales. Esto requiere una alta especificidad,
estabilidad del compuesto, penetrabilidad en la célula
diana y efecto celular letal.
La estructura de
la inmunotoxina empezó siendo la inmunoglobulina G (Ig G)
completa unida a la toxina por un puente disulfuro. Una vez ya en
el interior de la célula el puente disulfuro se reduce
liberando la toxina. Un paso adelante lo constituyó la
sustitución de toda la molécula de Ig G por una
parte de ella. El tratamiento de la Ig G con algunas proteasas,
como la "pepsina" o la "ficina", genera fragmentos
heterodímeros (Fab')2 y Fab' unidos entre sí por
puentes disulfuro. Cada dímero está formado por una
cadena pesada (H) y una ligera (L) unidas por un puente disulfuro
por la parte constante. Los fragmentos Fab' se pueden unir
directamente a toxinas por medio de enlaces disulfuro creados
como consecuencia de la reducción de (Fab')2.
La ventaja de Fab frente a la inmunoglobulina G entera
es su menor tamaño, lo cual facilita notablemente la
penetración en la célula. Los conjugados
toxina-Fab' pueden crearse bien por ingeniería
genética fusionando a nivel de ADN las regiones que
codifican por cada parte, o bien por medio de un enlace
químico que una las dos partes in vitro.
Las partes variables de
Fab', unidas por un puente disulfuro y que constituyen las Fv-Tx.
Sólo se pueden obtener por ingeniería
genética fusionando a nivel de ADN las regiones
codificantes correspondientes, pero son algo inestables. La
inclusión de un péptido de conexión
estabilizador en las moléculas recombinantes (Fv cs-Tx) ha
solucionado este problema.
La especificidad la da el anticuerpo monoclonal. Los
anticuerpos monoclonales son más específicos que
los polivalentes, por estar dirigidos contra una pequeña
parte específica de la proteína (epitopo) y no
contra su totalidad.
Los anticuerpos deberían estar dirigidos contra
las partes específicas de las proteínas que
estuvieran en los tumores normales. Por ejemplo, los anticuerpos
auténticamente específicos de carcinomas
deberían reconocer las formas mutadas de las
moléculas que controlan el crecimiento celular pero en sus
versiones normales. En la mayoría de los casos no se
consigue una especificidad tan precisa y la mejor
aproximación son los anticuerpos cuasi-específicos
que reaccionan con antígenos que se expresan predominantemente
en determinados carcinomas y muy poco en las células
normales.
Otros requisitos para que la
inmunotoxina sea eficiente son :
- Que el antígeno
esté en la superficie de la célula , de
ahí que se utilicen receptores o carbohidratos de membrana. - Que el complejo
antígeno-anticuerpo se interne eficazmente al citoplasma
celular por endocitosis.
Las toxinas que más se utilizan son la ricina, la
toxina diftérica y la exotoxina de Pseudomonas. Las tres
matan la célula inhibiendo la síntesis de
proteínas a nivel de los ribosomas. Son muy eficientes,
necesitándose muy pocas moléculas para inactivar
todos los ribosomas celulares. Sus genes han sido clonados,
caracterizados y parcialmente alterados para mejorar sus
propiedades tóxicas. El mayor inconveniente de las toxinas
es que pueden reaccionar indiscriminadamente con cualquier
célula causando toxicidad inespecífica. Se han
conseguido delecciones génicas que eliminan una
pequeña región de ADN responsable de la interacción toxina-célula; ello
disminuye notablemente la toxicidad inespecífica evitando
que toxinas conjugadas o aisladas, puedan causar la muerte de
otros tipos celulares.
El efecto antitumoral de la toxina es mucho más
rápido ( unos siete días ) que el desarrollo de una
respuesta inmunológica seria. Aún no disponemos de
la inmunotoxina perfecta que permita matar todas las
células tumorales sin producir efectos más o menos
deletéreos en el resto del organismo.
La causa principal de estos decepcionantes resultados es
que las inmunotoxinas no llegan realmente a todas las
células tumorales, particularmente en los tumores
sólidos. Los motivos de esta inaccesibilidad son varios:
poca vascularización del tumor, una gran presión
del fluido intersticial en los nódulos tumorales,
presencia de membranas basales envolviendo el epitelio tumoral y
ocultamiento de los posibles antígenos antitumorales que
deberían exhibirse en las membranas de las células
neoplásicas. Todo esto contribuye a que la efectividad de
las inmunotoxinas no haya alcanzado aún las espectativas
esperadas.
5.8.5 Incremento de la
inmunogenicidad tumoral y vacunas contra el
cáncer
Ciertas moléculas producidas en la célula
tumoral pueden convertirse en antígenos de rechazo. Las
células tumorales producen al menos dos tipos de
antígenos que pueden ser reconocidos por las
células T citotóxicas:
Los productos de los oncogenes, es decir,
proteínas aberrantes distintas a las originadas por los
protooncogenes y exclusivas de células
tumorales.
Antígenos tumorales formados por los productos de
genes embrionarios que no se expresan en las células
normales de adultos.
Claramente la habilidad para crear respuestas contra
antígenos propios específicos de tejido puede ser
de gran utilidad para el
tratamiento de cánceres derivados de órganos no
esenciales como la próstata, pero por otra parte los
antígenos específicos de tejido pueden crear
problemas de autoinmunidad, que deben ser superados.
Recientemente se han utilizado vacunas tumorales para el
tratamiento de pacientes con tumores sólidos. Las estrategias
empleadas han sido variadas y los resultados inconsistentes.
Sistemáticamente células tumorales irradiadas se
mezclaban con diversos coadyuvantes, como el bacilo de
Calmette-Guerín, para estimular la respuesta
inmunológica. La inclusión de coadyuvantes no
pareció incrementar la acción
mediada por las células T, pero en algunos casos las
células tumorales irradiadas mostraron un rechazo
inmunológico. Desgraciadamente, en la mayoría de
los casos la magnitud de la respuesta fue pequeña, y no se
consiguió erradicar tumores ya establecidos.
5.8.6 Perspectivas de la
terapia génica y molecular
Todos los tratamientos de terapia génica que se
han descrito están más indicados para
cánceres de tipo metastático que primario; dado que
aún hoy no se conoce el alcance de la curación, es
preferible que los pacientes hayan agotado otros métodos
de curación y que los riesgos de la terapia génica
sean menores de los derivados de la evolución de la propia
enfermedad.
Hay muchos problemas pendientes : cómo transferir
de manera estable y eficiente a tumores in vivo; cómo
evitar los riesgos de infección vírica en pacientes
y operadores; cómo generalizar los tratamientos de terapia
génica,…
La eficiencia de toda esta tecnología en la cura
de una de las mayores "plagas" de nuestra sociedad es
aún ínfima para el número de trastornos que
se ocasionan y a su especial rapidez y avance de la enfermedad.
La solución por tanto no es enfocar la respuesta a un
único tratamiento terapéutico, sino combinar con
diferentes técnicas (quimioterapia, radioterapia, tratamientos
farmacológicos de última generación,
terapia génica,….) las habilidades de éstos, y
preparar mediante estudios detallados y específicos la
mejor respuesta al caso. Así, que aún hoy tras
décadas de estudio y lucha por curar esta enfermedad , y
aunque estos avances resulten ser esperanzadores solo nos cabe
preguntarnos si será la respuesta definitiva a tanto
tiempo de espera y en muchos casos de impotencia y
resignación.
5.9 Terapia génica en
infección por HIV
La terapia génica para el HIV está
destinada a realizar muchos propósitos. Los
propósitos son proteger células no infectadas
residuales y eliminar células infectadas. Pero lo que
más se intenta es reducir la infección en personas
infectadas y evitar la expansión del virus a través
de la población.
Haremos un breve repaso del ciclo infectivo del virus a
través de estos esquemas:
5.9.1 Objetivos
potenciales de la terapia génica para infección
por el HIV
La mayoría de los procesos del
ciclo viral tiene puntos vulnerables que pueden ser
desvaratados con métodos genéticos.
Algunos aspectos como son la transcripción y
translación son llevadas a cabo por la maquinaria de la
célula hospedadora es probable que la inhibición
significativa pueda llevar a la muerte celular. Procesos
específicos del virus son utilizados como puntos de
arranque: la entrada en la célula, la
transcripción inversa, o la integración. La
interacción entre los ARN tat y rev con proteínas
es un punto claramente vulnerable al igual que el
empaquetamiento del ARN genómico.
5.9.2
Inmunización por proteínas del HIV
La expresión in vivo de una proteína
viral puede ser utilizada como una vacuna genética para
atacar al virus. Usando sistemas con virus influenza en
modelos
animales han demostrado la eficacia de esta vacuna
genética, en la cual una inyección directa de ADN
plasmídico puro que codifica proteínas virales
lleva a una expresión persistente de los genes
virales.
En infección por HIV es importante conservar
regiones del virus genómico como inmunogénico
porque el virus posee gran habilidad de mutación y de
evitar respuestas neutralizantes. Se ha visto que en pacientes
con SIDA que la
evasión de la respuesta inmune contra epitopos
específicos de las células T citotóxicas
pueden ocurrir incluso en porciones relativamente conservadas
del HIV, como es el gag. La entrega de genes virales junto a
genes que codifican moléculas inmunoestimulatorias, como
la molécula B7/BB1, es otro desarrollo
potencial.
El pg160, proteína precursora de la envuelta
expresada en células singénicas, está
siendo utilizada para inducir respuestas inmunitarias humorales
y celulares en ratones.
Una vez que células que desarrollan la
inmunidad expresan la proteína inmunogénica
probablemente serán destruidas por contener un virus
transcipcionalmente activo. La gran proporción de
células infectadas albergando un virus latente
persistirá y proveerá un pozo del que
emergerán mutantes capaces de evitar la respuesta
inmunitaria.
Es por esto por lo que la inmunización con
proteínas del HIV sigue siendo muy difícil por no
decir casi imposible, al menos con la tecnología actual.
Además hay que sumar el hecho de que es un virus con una
elevada tasa de mutación, con lo cual la creación
de inmunidad para un tipo de producto génico puede verse
inútil si el virus cambia por
mutación.
5.9.3 Inhibición
mediada por interferón
ADNs copia de interferones han sido clonados e
insertados en vectores para su expresión constitutiva o
inducible en células diana. El tratamiento con
interferón induce algunas proteínas celulares una
de las cuales ( RBP 9-27 ) aparentemente interactúa con
la estructura en bucle del ARN que codifica rev y puede inhibir
la expresión de proteínas gag-rev
dependientes.
5.9.4 Destrucción
autolítica de células infectadas
Se han desarrollado varias estrategias para que
células infectadas por HIV se autodestruyan. La
subunidad A de la toxina diftérica (DT-A) está
codificada por un gen que puede ser utilizado como un gen
suicida inducible. Sólo una pequeña
molécula de DT-A puede ser suficiente para matar a una
célula. Otros genes letales que se usan incluyen a la
timidina quinasa de HSV (tk) , que es inocua al menos que en el
medio haya ganciclovir o aciclovir. En caso de la presencia de
estos compuestos, que pueden ser fosforilados por la tk ( como
ya dijimos en su aplicación en el cáncer ), la
célula muere. Otros resultados prometedores se han
obtenido usando in vitro la toxina quimérica CD4 de
Pseudomonas que mata células que producen el pg120 del
virus.
Esta forma de terapia tiene inconveniente que reside
en la interacción tat-LTR. El LTR del HIV es un promotor
muy promiscuo , que es activado por un gran número de
proteínas además de tat, incluyendo factores
transcripcionales como los de los citomegalovirus. Hay un
control limitado de la expresión del gen suicida
inducible por tat, y la destrucción de la célula
puede ocurrir bajo otras circunstancias que no sean la
infección por HIV.
5.9.5 Interferencia
directa con procesos virales
La interferencia en la replicación viral se
puede hacer por interrupción de procesos virales como
son la entrada en la célula, o más
fácilmente, en la salida, aquí el ADN del
provirus no es un objetivo práctico.
Para aumentar la posibilidad de inhibición
antes de la integración del HIV probablemente se
necesite la producción constitutiva de genes
antivirales.
– La interferencia se puede realizar por varios
métodos . Uno de ellos es la modificación de la
molécula CD4. Bloqueando la molécula CD4 para que
el pg120 viral no pueda adsorberse sobre él es una
proposición esperanzadora. In vitro se ha visto
también que células mutantes para el CD4 no
reconocen la glicoproteína de la envoltura del HIV por
lo que son resistentes ante la infección del virus. Otra
manera sería inyectar grandes cantidades de CD4 en la
sangre, pero se ha visto que la dosis requerida para que sea
detectable en el plasma, es más alta de lo
esperada.
Otros se realizan utilizando terapia basada en
nucleótidos, de los que hay tres clases de ARN
antivirales y que son: el ARN antisentido, los ribozimas y el
ARN decodificante.
– El ARN antisentido para el LTR de HIV es entregado
por un vector AAV, y produce una reducción superior al
90% de las replicación del HIV. Estas moléculas
antisentido necesitan estar presentes en más
número que su secuencia diana, lo que dificulta su
producción y eficacia.
– Sin embargo, los ribozimas, como se regeneran
después de cada interacción catalítica no
se requieren en gran cantidad. Los ribozimas anti-HIV
expresados establemente en células HeLa-CD4+ pueden
inhibir la replicación del HIV. Este mismo efecto se
produce en blancos que posean la integrasa RT y las regiones
tat y env.
5.9.6 Estrategias
centradas en proteínas
Proteínas mutantes pueden a veces interferir en
la funciones normales. Esto se conoce como
fenómeno transdominante negativo , en
el que un pequeño número de proteínas
mutantes pueden interferir en los efectos de una gran cantidad
de proteínas normales. Las proteínas más
utilizadas para este experimento son las proteínas tat y
rev.
También se ha visto que en mutantes
dominantemente negativos de la proteína de la envoltura
puede inhibir la producción de HIV, y mutantes
dominantemente negativos en el dominio de
unión a CD4 pueden reducir la cantidad de CD4 y
disminuir la producción del virión.
5.9.7 Secuestro en
trans de proteínas
En teoría se pueden secuestrar algunas
proteínas estructurales del virus. El secuestro de una
envoltura viral por un CD4 que contiene una señal de
retención del retículo endoplasmático, se
ha podido ver en varios experimentos . Cadenas sencillas de
anticuerpos se han desarrollado para secuestrar la
proteína de envoltura en el retículo
endoplasmático. La co-transfección de cadenas
sencillas de anticuerpos específicos para pg120,
también reduce los niveles de partículas HIV
infecciosas, sin afectar al nivel de producción de la
proteína gag.
Estas metodologías son particularmente
sensibles al acercamiento de la terapia génica y parece
probable que dentro de los próximos 5-10 años una
combinación de terapias, incluyendo agentes
farmacológicos y agentes de terapia génica,
puedan ser usados en concierto para minimizar la
propagación del HIV dentro de un individuo
afectado y de este modo prolongar su vida libre de enfermedad.
Una vacuna basada en la terapia génica es también
una seria posibilidad. El HIV por si mismo puede
paradójicamente llegar a ser una valiosa arma
terapéutica y la terapia génica del SIDA puede
llegar a ser el campo pionero para el desarrollo de
acercamientos similares a otros agentes infecciosos.
VI. TERAPIA GÉNICA:
PERSPECTIVAS FUTURAS Y CONSECUENCIAS
Datos económicos indican que los costes de
los primeros años de transplantes cardiacos son unos
90.000$ por paciente (dólares de 1.983) en los EEUU,
sería razonable preguntarse si la terapia
génica será otra tecnología cara a
medio plazo. Si se emplea en transplantes de médula
ósea, en la terapia génica humana será
trabajada intensamente y supondría unos
considerables costes iniciales.Pero aún cuando nadie asigna un valor
económico en el mejoramiento de la calidad de
vida de los pacientes curados, lo más seguro es
que algún día la terapia génica
costará considerablemente menos que la
hospitalización repetitiva por enfermedades como la
anemia
falciforme o la fibrosis mística. En breve, para
pacientes que sufran alguna enfermedad genética
causado por el defecto en un gen, la terapia génica
se puede convertir en un método de cura bastante
costoso.En un futuro más lejano, las perspectivas
para la terapia génica en humanos todavía no
están claras . Pero si se rompiese el eslabón
entre el transplante de médula ósea y la
terapia génica, ésta se podría aplicar
a un círculo de pacientes más
extensos.Por ejemplo, si vectores específicos para
un particular tipo de célula diana se pudiera
desarrollar, la combinación vector/gen, quizá
pueda ser administrada de forma intravenosa. A este nivel,
si alguna vez se alcanza, la medicina estará en el
umbral de una nueva era para el tratamiento de más
de 3.000 desórdenes genéticos que afecten a
nuestra especie.- CUESTIONES
ECONÓMICASEl rango potencial y la versatilidad de la terapia
génica han sido perfilados en puntos anteriores de
este trabajo.
Esta es una nueva forma de intervención
terapéutica a un nivel molecular, con aplicaciones
en muchas áreas del tratamiento médico que
engloba desde la corrección de un locus individual
de un defecto génico heredado por
inmunización, tratamiento de enfermedades
infecciosas hasta el cáncer. Esta es también
una nueva farmacología.Mientras muchos fármacos corrientes
persiguen modificar procesos endógenos por la
aplicación de novedosos, compuestos artificiales, la
terapia génica reparte un agente
biológicamente activo muy específico a un
sitio determinado y a la vez con la posibilidad de
permanentes, transitorios o inducibles estados de la
expresión.Como un nuevo fármaco debe ser testado en
el contexto de la herencia. La heredabilidad requiere dos
funciones: primero, la transmisión de la
información de generación en
generación, y segunda, la expresión de la
herencia.Transmisión y expresión están
separadas a nivel molecular, y , en organismos
multicelulares, a nivel celular. La determinación
celular va seguida por la diferenciación en un
estado temprano que separa irreversiblemente el linaje
somático de los portadores potenciales de
información a la siguiente generación: las
células de la línea germinal.La expresión del gen terapéutico
puede ser afectada transitoriamente por el uso de vectores
que no se integran o por células diana con una vida
biológica limitada. Si, como es normal, la
expresión es requerida a largo plazo, deberemos usar
vectores que se integren o autoreplicativos. Estos son
más difíciles de distribuir y
controlar.El material genético en un cromosoma
está influido directamente por partes del genoma
cercanas y distantes que actúan en cis y trans. Esto
no es una sorpresa ya que uno de los mayores problemas con
la transferencia génica como práctica
corriente es la expresión a largo plazo del gen
transducido cuando la transferencia se produce en
secuencias mínimamente contextuales. La
familia del gen de la globina lo ilustra bastante
bien.El control de la expresión depende de
cuatro regiones distantes aguas arriba reconocidas por su
hipersensibilidad ADNasa I y se les llamó
regiones para el control del locus (LCRs).
Aún con estas regiones incluidas la transferencia
del gen de la globina era imprescindible ya que se
podía reorganizar de diferentes maneras.¿Cómo podemos solventar este
problema? En principio se comenzó a "limpiar" la
construcción de motivos de interferencia
extraños por escaneo de las secuencias del vector
que actuaban como señales cis, las cuales
podrían ser las responsables de las distintas formas
de reorganizar, y se intentó posteriormente
eliminarlos sistemáticamente por delección o
por mutación puntual dirigida.La sustitución por un gen anormal o no
funcional por recombinación homóloga es una
segunda posibilidad, y teóricamente, la forma ideal
de terapia génica. Hasta ahora esto se ha ido
practicando sucesivamente en líneas celulares o en
células stem embrionarias de animales. La confianza
que nos proporciona los procesos celulares endógenos
para la recombinación son insatisfactoriamente
bajos. Sin embargo, desde hace años se conocen
enzimas que catalizan la escisión e inserción
de material genético por reconocimiento de una
secuencia nucleotídica particular, esto es lo que se
está usando en la transferencia de genes
eucarióticos.El sistema mejor conocido es el sistema cre/loxP
de los bacteriófagos. La enzima cre reconoce una
secuencia oligonucleotídica particular y corta una
pieza de material genético existente entre dos de
esas secuencias, y después ligará los
extremos del material genético cortado. Las
secuencias que cortan las enzimas se llaman
loxP. Introduciendo sitios loxP se crean
sitios de inserción y delecciones específicas
en células stem embrionarias.Una tercera posibilidad es intentar transferir una
unidad genética grande que contenga el gen y todo la
unidad llevará asociada regiones de control junto a
genes accesorios en un formato auto replicativo. A esto se
le llama cromosoma artificial , y que nos
supera las limitaciones en el tamaño del ADN que
puede ser transportado a base de vector. Esto se ha
demostrado utilizando vectores YAC (cromosoma artificial de
levadura) para crear ratones transgénicos. Los
cromosomas artificiales también
evitan los problemas en el control del sitio de
integración del ADN exógeno. Los
centrómeros y telómeros de levadura parece
que no son funcionales en células de mamíferos por lo que el objetivo
más corriente sería la producción de
vectores de cromosomas artificiales que lleven los
centrómeros y telómeros que combinen la
habilidad de transportar grandes piezas de ADN (varios
cientos de kilobases), con la capacidad de
segregación con un cromosoma independiente en
sincronía con el genoma del hospedador en la
célula en división.Por último, varios sistemas están
siendo explorados para el reparto de hormonas, factores de coagulación,
anticoagulantes, y otros agentes terapéuticos.
Cuando sus genes estén introducidos dentro de
fibroblastos o células del endotelio vascular, sus
productos pueden ser detectados en sangre durante diversos
períodos de tiempo.Estudios recientes en ratones sugieren que
mioblastos pueden ser particularmente ventajosos como
células diana para el reparto de proteínas
recombinantes. Transferencia génica in vitro seguida
por el reinjerto de las células está siendo
explorado para restaurar funciones de enfermedades
crónicas del sistema
nervioso. Si se consigue probar como efectivo tales
técnicas de implantación combinadas con los
genes transfectados podrían ofrecer un nuevo camino
de tratamiento para desórdenes crónicos tales
como el Parkinson o la enfermedad de Alzheimer.En otoño de 1.998, French Anderson uno de
los pioneros de la terapia génica propuso una
solicitud de aprobación de un protocolo para el estudio de la terapia
génica in útero. Anderson se propone tratar
dos enfermedades genéticas muy graves; la
alfa-talasemia, enfermedad fatal de la sangre, debida a un
defecto del gen de la hemoglobina, y una deficiencia
inmunitaria grave, SCID (Severe Combined Inmune
Deficiency), resultado de la carencia de un gen esencial,
el del enzima adenosina desaminasa (ADA).Se propone ensayar
el metido en fetos portadores de estas anomalías
genéticas, cuyas madres hayan decidido abortar.
Sólo después de la interrupción del
embarazo
podrán los investigadores verificar la eficacia del
tratamiento.Todavía se necesitarán de dos a tres
años de trabajo en vectores y de ensayos en el
animal para que estos proyectos sean técnicamente
aceptables. Si la terapia génica in útero se
revela eficaz, el principal problema ético que, con
el tiempo, suscitará este tipo de
intervención en el feto
será el riesgo de
modificación de las células del grupo
germinal, precursoras de las células sexuales y, por
tanto, del patrimonio genético que se transmite
a la descendencia.Ahora bien, la prohibición de la terapia
goza de consenso. El proyecto
de convención de bioética del Consejo de Europa,
por ejemplo, excluye tal posibilidad. Incluso del RAC
(Recombinant Advisory Committee), órgano del
National Institutes of Health (NIH). - PERSPECTIVAS
FUTURAS - CONSECUENCIAS DE LA
TERAPIA GÉNICA
La modificación del material genético de
una célula afecta tanto a la célula como a sus
descendientes. Hay un gran debate de los
peligros potenciales del uso de un tratamiento que diseña
deliberadamente cambios genéticos que son potencialmente
propagables.
Estos miedos se centran sobre todo en las alteraciones
genéticas de la línea germinal. Se cree que los
riesgos de estos tratamientos. Pero, ¿cuáles son
estos riesgos?
Todas las integraciones cromosómicas, aparte de
los cambios homólogos, poseen el potencial de
alteración de locis endógenos fortuitos y por lo
tanto producir mutagénesis, que puede derivar en
oncogénesis.
Si realizamos la terapia génica en células
somáticas nosotros no transmitiremos los genes manipulados
en esas células somáticas a las futuras
generaciones pero alteramos la línea genética del
individuo. La intervención directa en las células
somáticas difiere del tratamiento médico
convencional sólo en que aquí hay una clara y
directa conexión entre la terapia y la selección
genética.
En el caso de síndromes causados por locis
dominantes el conjunto completo de genes está representado
por los individuos afectados. Su éxito reproductivo por lo
tanto influye directamente en el tamaño de este conjunto
en la siguiente generación. Si los individuos llevan
alelos no reproductivos, la frecuencia del gen en la
población está mantenida por que ocurran nuevas
mutaciones.
En las enfermedades genéticas ligadas al sexo, recesivo
en la mujer y
dominante en el hombre. Como
el número de afectados es mucho mayor (todos los machos
que lleven el alelo se verán afectados) la influencia del
éxito de la terapia en la frecuencia génica
será también mayor.
La modificación deliberada de la línea
germinal tendría efecto sobre la estructura de la
población sólo por una transformación
genética a gran escala o
alternativamente donde el genoma mutado tenga una alta ventaja
selectiva. Un hecho preocupante sería la
introducción de resistencia a una enfermedad
patógena. Si sólo "los elegidos" son protegidos de
la enfermedad podría existir la posibilidad de un gran
cambio genético en la población
¿Sería la terapia génica en la línea
germinal realmente necesaria?
La terapia génica somática, tiene un
efecto directo sobre el paciente individual pero alguna
transformación génica de la línea germinal
puede sólo tener efectos sobre la descendencia aún
no nacida. Esto por lo tanto no afectará al paciente que
está siendo tratado. Con las posibilidades de investigación de prenatales de la
preimplantación tanto como de la donación de
esperma y óvulos y adopción
es muy difícil ver como la intervención deliberada
en la línea germinal puede ser éticamente
justificable. No obstante esta idea será más
profundizada en el siguiente apartado, sobre la ética en
la terapia génica.
OROZCO OROZCO, E. y P.,GARIGLIO VIDAL, (1999). Genetica
y biomedicina molecular. Mexico D.F. Edit. Limusa S.A. pp
111-118.
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Rómulo Aycachi Inga
Bach. En Biología
Tema: Fotosíntesis – Biología
General – Botánica
Setiembre 2004
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